改善保質(zhì)期和儲(chǔ)存條件的機(jī)會(huì)

當(dāng)需要冷凍以保持疫苗穩(wěn)定時(shí)，終端使用的流通、儲(chǔ)存和處理是有嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)的，成本會(huì)相應(yīng)增加。為了便于流通，疫苗在2–8 °C 下能夠保持穩(wěn)定將是理想的保存條件。在下一節(jié)中，我們將專注于研究如何實(shí)現(xiàn)這種儲(chǔ)存條件，因?yàn)檫@些被視為大規(guī)模使用mRNA 疫苗（例如在大流行中）的瓶頸。

4.1 . 輔料

上一節(jié)關(guān)于mRNA疫苗穩(wěn)定性的結(jié)論是，為了制造更穩(wěn)定的mRNA-LNP疫苗，穩(wěn)定mRNA是首要目標(biāo)。顯然，用于mRNA 的疫苗制劑的任何輔料都必須不含RNase。Muralidhara等人的綜述中總結(jié)了大量有關(guān)輔料和制劑環(huán)境的影響。

Muralidhara等人提出的一些輔料，Moderna 和 Pfizer/BioNTech 已經(jīng)將其用于mRNA 疫苗。制劑中的輔料用作緩沖劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑和冷凍保護(hù)劑或具有雙重作用。例如，Moderna 使用 Tris-HCl 緩沖液，它對(duì)核酸大分子具有額外的穩(wěn)定作用，因?yàn)門ris-HCl也是一種羥基自由基清除劑。選擇這些輔料時(shí)，應(yīng)考慮產(chǎn)品可能需要在低于零的溫度下儲(chǔ)存，而輔料會(huì)受到冷凍的影響。緩沖系統(tǒng)和滲透壓調(diào)節(jié)劑的選擇很重要，因?yàn)槔鋬龊?pH 值可能會(huì)發(fā)生變化，如磷酸鈉鹽組成的緩沖系統(tǒng)，冷凍時(shí)pH會(huì)出現(xiàn) 3.5 個(gè)pH 單位的下降（在磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉組成的緩沖體系中，磷酸氫二鈉的溶解度會(huì)隨溫度的降低急劇降低，導(dǎo)致緩沖體系中磷酸氫二鈉濃度大幅度下降，體系pH也隨之發(fā)生大幅度降低）。

組氨酸緩沖液在冷凍時(shí)pH波動(dòng)則很小，但是，當(dāng)從 0°C 下降至 -30°C 時(shí)，pH值依然可能會(huì)下降 0.5個(gè)pH單位。此外，NaCl（滲透壓調(diào)節(jié)劑）溶液的共晶溫度為 -21 °C，可以添加一些其他輔料比如抗氧化劑、非還原性自由基清除劑（例如乙醇）或金屬螯合劑。然而，我們選用輔料時(shí)需要納入考慮這些輔料在0°C 以下或0°C以上時(shí)能多大程度地改善mRNA-LNP 制劑的穩(wěn)定性。

pH優(yōu)化對(duì)于mRNA 疫苗的穩(wěn)定性也很重要，因?yàn)?pH 會(huì)影響 mRNA 的水解速率和LNP穩(wěn)定性。通常，mRNA 在弱堿性環(huán)境中穩(wěn)定。Moderna 和 Pfizer/BioNTech 疫苗的 pH 值均在 7 到 8 之間。Wayment-Steele 等人指出陽(yáng)離子脂質(zhì)*帶正電時(shí)表面的pH值可能高于周圍的水介質(zhì)。

4.2 . 凍干

由于水的存在會(huì)引發(fā) mRNA-LNP 的降解反應(yīng)，因此凍干將是提高 mRNA-LNP 制劑長(zhǎng)期穩(wěn)定性的可行途徑。輝瑞病毒疫苗研究負(fù)責(zé)人Philip Dormitzer 已經(jīng)提到輝瑞希望將凍干技術(shù)用于 mRNA-LNP疫苗。此外，Moderna公司的凍干形式的巨細(xì)胞病毒mRNA疫苗(mRNA-1647) 已進(jìn)入2期臨床試驗(yàn)，公司宣稱該疫苗在5 °C 保存的保質(zhì)期≥ 18 個(gè)月。但是，目前在公開資料中找不到有關(guān)該制劑方和生產(chǎn)工藝的詳細(xì)信息。

冷凍干燥廣用于病毒滅活疫苗，關(guān)于冷凍干燥技術(shù)應(yīng)用于mRNA制劑也進(jìn)行了相關(guān)研究，證明了冷凍干燥可以提高mRNA的穩(wěn)定。瓊斯等人的研究表明，用海藻糖配制的凍干mRNA在4°C下可穩(wěn)定儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)10個(gè)月。脂質(zhì)納米顆粒也可以被成功冷凍干燥，在冷凍干燥過程中，結(jié)構(gòu)可能會(huì)被改變，因此制劑中應(yīng)包含穩(wěn)定這些膠體顆粒的凍干保護(hù)劑，蔗糖或海藻糖常用于凍干保護(hù)。對(duì)mRNA 或 LNP 的研究表明，凍干可能是提高mRNA-LNP 穩(wěn)定性的一種可行方式，能夠使mRNA-LNP疫苗在更高的溫度下儲(chǔ)存。然而，凍干也有其缺點(diǎn)，因?yàn)閮龈芍苿┬枰诮o藥前重新配制，并且凍干工藝是一個(gè)相對(duì)昂貴、耗能和耗時(shí)的過程。另一方面，保持 mRNA 疫苗深度冷凍也是有代價(jià)的，因此下一步應(yīng)當(dāng)研究?jī)龈商岣適RNA-LNP 制劑穩(wěn)定性的可行性。

Shirane等人將含乙醇的siRNA-LNP制劑凍干后再進(jìn)行復(fù)溶，隨后用復(fù)溶的制劑和新鮮制備的（通過超濾去除乙醇）的制劑分別給藥，動(dòng)物體內(nèi)的基因敲除效率沒有差異。這些研究結(jié)果在一定程度上表明了mRNA-LNP 凍干的可行性，同時(shí)也應(yīng)當(dāng)考慮研究中所用的siRNA和mRNA之間存在差異。

關(guān)于mRNA-LNP 凍干研究的公開數(shù)據(jù)很少，但趙等人近發(fā)表了一篇論文，研究 mRNA 脂質(zhì)納米粒。他們研究了這些含有可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)的納米顆粒的冷凍干燥效果，文章中沒有提供冷凍干燥過程的細(xì)節(jié)。與Shirane 等人獲得的 siRNA-LNPs 數(shù)據(jù)相反，他們發(fā)現(xiàn)凍干前和凍干復(fù)溶后，體外測(cè)試顯示活性沒有損失，但體內(nèi)活性卻有所下降。因此，mRNA-LNPs 的冷凍干燥可能比研究報(bào)道的更為困難，闡明體內(nèi)活性下降背后的機(jī)制將是十分重要的。可能是配方不適合冷凍干燥，或者凍干過程本身存在缺陷，作者推測(cè)可能是凍干導(dǎo)致mRNA-LNP納米結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致體內(nèi)活性下降，因?yàn)檫@種改變可能會(huì)影響mRNA-LNP微粒與血清蛋白結(jié)合的特性，而這些特性在體外研究中是無(wú)法顯示的。因此，進(jìn)一步改進(jìn)制劑方和冷凍干燥工藝可能會(huì)達(dá)到較優(yōu)的mRNA-LNP凍干效果。

另一種方法，如果mRNA-LNPs的凍干有問題，可以改成單獨(dú)凍干mRNA并在給藥前與 LNPs 結(jié)合。Ball等人用了相反的方法，他們通過用siRNA的乙醇溶液與冷凍干燥后復(fù)溶的LNP結(jié)合。他們終總結(jié)到：“向復(fù)溶后的LNP溶液中加入乙醇既不方便也不實(shí)用，因?yàn)樵谟糜趧?dòng)物或臨床之前需要透析除去乙醇"。Leavit等人發(fā)現(xiàn)將mRNA凍干復(fù)溶后與空白LNP混懸液混合， mRNA 被LNP包封，給藥結(jié)果顯示mRNA依然具有活性。

除了需要在凍干過程中保持 mRNA-LNP 的完整性之外，凍干工藝還有其他局限性，例如該凍干過程高能耗和需要其他成本，在疾病大流行時(shí)，在全球范圍內(nèi)急需的凍干產(chǎn)能無(wú)法在短時(shí)間得到滿足。因此需要考慮替代的干燥技術(shù)，關(guān)于mRNA-LNP 的噴霧干燥研究只能找到一篇文獻(xiàn)，該噴霧干燥過程需要聚合物（例如 Eudragit）作為 mRNA-LNP 的穩(wěn)定劑以確保體內(nèi)活性。超臨界干燥技術(shù)也是冷凍干燥的另一種可替代選擇；它們已被證明適用于其他生物大分子的干燥，如蛋白類藥物。

結(jié)論和前景

本綜述概述了不同因素如何影響mRNA 疫苗在其儲(chǔ)存過程中的穩(wěn)定性。我們得出的結(jié)論是，mRNA暴露于水可能是mRNA 疫苗不穩(wěn)定的主要因素。這意味著減少與水的接觸將是提高 mRNA 疫苗穩(wěn)定性的一種有效的方法。

對(duì)mRNA-LNP結(jié)構(gòu)的研究表明，mRNA與可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)和水一起位于LNPs的核，這是mRNA可能屏蔽水的重要證據(jù)。當(dāng)前尚不清楚LNP 中的可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)是否以及如何與mRNA相互作用，這需要更多的研究工作來確認(rèn)LNP內(nèi)部結(jié)構(gòu)。LNP內(nèi)部的pH值已被確定為與其穩(wěn)定性密切相關(guān)。另一個(gè)需要研究的問題是專門分析 mRNA 分子的降解類型，以及序列調(diào)整是否有助于維持鏈的完整性。這也可以與 mRNA 的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的表征和優(yōu)化相結(jié)合，因?yàn)橛雄E象表明一些折疊結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定。

本報(bào)告是對(duì) mRNA-LNP 疫苗不穩(wěn)定性背后的因素的文獻(xiàn)綜述，還指出了規(guī)避這些不穩(wěn)定性因素的解決方案，從而開發(fā)出能耐受更高儲(chǔ)存溫度的mRNA-LNP疫苗，從而解決當(dāng)前疫苗流通過程所需儲(chǔ)存條件苛刻的問題。