LNP穩(wěn)定性

除了mRNA 的完整性外，LNP 的穩(wěn)定性對(duì)于 mRNA-LNP 疫苗的質(zhì)量也至關(guān)重要。目前的mRNA疫苗沒(méi)有披露關(guān)于LNP 穩(wěn)定性測(cè)試的數(shù)據(jù)，但 Onpattro (patisaran) 的siRNA-LNP 制劑保存在2~8°C 之間時(shí)具有三年的有效期，同時(shí)該產(chǎn)品不能冷凍保存。

Onpattro 的LNP 系統(tǒng)的組成是：可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)DLin-MC3-DMA、DSPC、膽固醇、PEG2000-C-DMG（見(jiàn)表 1）（摩爾比 50:10:38.5:1.5），它們?cè)诮M成上類(lèi)似于 Comirnaty 和 mRNA-1273的LNP。在一項(xiàng)siRNA-LNPs 的研究中用類(lèi)脂質(zhì)306O 13代替DLin-MC3-DMA，樣品水溶液在 2°C 、pH 7 的環(huán)境下下能穩(wěn)定儲(chǔ)存156 天，其粒徑和siRNA包封率沒(méi)有明顯變化。Suzuki 等人的補(bǔ)充研究表明 siRNA-LNP 能在 4°C 環(huán)境下穩(wěn)定儲(chǔ)存1.5。總之，這些數(shù)據(jù)都表明是mRNA 的不穩(wěn)定，而不是 LNP 的不穩(wěn)定，導(dǎo)致了當(dāng)前mRNA-LNP疫苗的儲(chǔ)存條件嚴(yán)苛和保質(zhì)期短。

Fan等人總結(jié)了脂質(zhì)體和 LNP的穩(wěn)定性及其質(zhì)量屬性。LNP 可以承受化學(xué)和物理不穩(wěn)定性，化學(xué)不穩(wěn)定性包括 LNP 中易水解和氧化的脂質(zhì)的降解。脂質(zhì)氧化可能發(fā)生在不飽和脂肪酸部分（Comirnaty 和 mRNA-1273 不存在該問(wèn)題）和膽固醇，氧化可能是PEG2000 -DMG中PEG基團(tuán)存在雜質(zhì)導(dǎo)致的結(jié)果。除此之外，氧化性雜質(zhì)也可能導(dǎo)致包封的mRNA 氧化。脂質(zhì)例如 DSPC 和可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)中的羧酸酯鍵容易受溫度和pH依賴(lài)性的水解的影響（圖 6）。

LNP 穩(wěn)定性的另一個(gè)關(guān)鍵因素是物理穩(wěn)定性，主要有三種類(lèi)型的物理不穩(wěn)定性：包封的藥物的聚集、融合和泄漏。 LNP 在儲(chǔ)存和流通過(guò)程中容易發(fā)生 LNP 的聚集，所以為了增加穩(wěn)定性，LNP 中通常添加PEG化脂質(zhì)，LNP微粒表面的PEG 分子可防止LNP 聚集。

另一種類(lèi)型的物理不穩(wěn)定性主要由于mRNA 的泄漏，這主要影響包封產(chǎn)品的穩(wěn)定性。值得注意的是，包封率通常 > 90%，并且尚未報(bào)道過(guò)在儲(chǔ)存期間出現(xiàn)mRNA泄露（用RiboGreen監(jiān)測(cè)）的情況。未包封的mRNA（“裸露的mRNA"）幾乎不會(huì)被細(xì)胞攝取；而且它會(huì)迅速被降解，因此無(wú)法用于翻譯。

圖6 用于 mRNA-LNP疫苗BNT162b2 (Comirnaty) 和 mRNA-1273的脂質(zhì)。

由于注射 mRNA-LNP疫苗時(shí)的超敏反應(yīng)可能與PEG化脂質(zhì)有關(guān)，因此，已經(jīng)研究了防止聚集體形成的替代脂質(zhì)。使用多聚肌氨酸修飾脂質(zhì)能使脂質(zhì)遞送系統(tǒng)更加穩(wěn)定，在防止LNP聚集的同時(shí)能夠減少超敏反應(yīng)。但是目前仍然需要更多的實(shí)驗(yàn)來(lái)確定這種 PEG化脂質(zhì)替代品是否能真正的提高 mRNA 的穩(wěn)定性（例如不含過(guò)氧化物，注：目前使用的PEG脂質(zhì)由于工藝原因，會(huì)有一定的過(guò)氧化物雜質(zhì)，這會(huì)引起LNP中其他含有不飽和鍵的脂質(zhì)和mRNA的氧化降解）。

分析 LNP 穩(wěn)定性

Fan 等人在前面提到的文章中對(duì)監(jiān)測(cè) LNP 穩(wěn)定性的分析方法進(jìn)行了專(zhuān)業(yè)評(píng)估。我們推薦感興趣的讀者可以查看相關(guān)文獻(xiàn)。

mRNA-LNP中哪個(gè)成分更不穩(wěn)定？

迄今為止，已有幾項(xiàng)研究考察了在儲(chǔ)存期間穩(wěn)定 mRNA 和穩(wěn)定 LNP 的方法。然而，兩者之中哪一個(gè)才是mRNA-LNP穩(wěn)定性的瓶頸？當(dāng)mRNA-LNP 制劑未冷凍時(shí)，是mRNA 降解？還是 LNP 降解導(dǎo)致穩(wěn)定性問(wèn)題？還是 mRNA 與 LNP 的組合？

與mRNA-LNP 系統(tǒng)相比，包封化學(xué)修飾且高度穩(wěn)定的siRNA 分子（例如 Onpattro）的LNP系統(tǒng)具有更長(zhǎng)的有效期。這表明當(dāng)前的穩(wěn)定性瓶頸不是 LNP，而是 mRNA。

迄今為止，公開(kāi)資料還沒(méi)有披露關(guān)于 mRNA-LNP 制劑中 mRNA 和 LNP 完整性的研究報(bào)告。在研究存儲(chǔ)效果的少數(shù)研究中，例如 Zhang等人的研究，并沒(méi)有考察長(zhǎng)期儲(chǔ)存的穩(wěn)定性。因此，我們將首先研究裸露的mRNA的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，但需要注意的是，這可能與包封在 LNP中的 mRNA 的穩(wěn)定性有所不同（見(jiàn)下文）。

在Pascolo等人的綜述中，裸露的mRNA的水溶液在無(wú)RNase的情況下只能在4°C下儲(chǔ)存幾天。這似乎符合目前對(duì) mRNA 不穩(wěn)定性的看法。目前關(guān)于裸露的mRNA長(zhǎng)期穩(wěn)定性的研究表明，mRNA 需要冷凍或干燥才能保持更長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定。

Roesler等人2009年的研究表明，編碼熒光素酶的mRNA 在無(wú)RNA酶存在的條件下，分別以液體或凍干形式在室溫下儲(chǔ)存，表達(dá)效率分別在第8天和第16天開(kāi)始出現(xiàn)降低，凍干輔料和凍干工藝方面未經(jīng)優(yōu)化（見(jiàn)圖 7）。同時(shí)本研究無(wú)法得出關(guān)于2-8℃溫度下長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性的結(jié)論，因?yàn)榉€(wěn)定性研究只考察了32 天。

Wayment-Steele等人經(jīng)過(guò)基于理論降解速率計(jì)算，預(yù)測(cè) 長(zhǎng)度為4000 nt的mRNA在 pH 7.4 和5 °C 的條件下，存儲(chǔ)的半衰期為 941 天。他們注意到較長(zhǎng)的mRNA序列，例如SAM，更容易發(fā)生水解。由于這是jin基于水解降解動(dòng)力學(xué)的理論計(jì)算結(jié)果，可能會(huì)低估 了mRNA的實(shí)際降解速率，例如，當(dāng)存在痕量RNase時(shí)，必須對(duì) mRNA 的穩(wěn)定性進(jìn)行更多研究才能知道m(xù)RNA實(shí)際存儲(chǔ)的穩(wěn)定性情況。

圖7 通過(guò)轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞中熒光素酶表達(dá)效率分析mRNA在水中的穩(wěn)定性

這些研究表明，在水溶液中 mRNA 可能不如 LNP 穩(wěn)定。然而，應(yīng)該重申的是，這兩種成分的穩(wěn)定性考察結(jié)果可能與LNP包封mRNA 的情況不同。如前幾節(jié)所述，mRNA 與可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)、膽固醇和水一起位于 LNP 核內(nèi)部（參見(jiàn)圖 4）。這意味著 mRNA 處于水性環(huán)境中，因此容易發(fā)生水解，其水解的機(jī)制可能與溶液中 mRNA水解 的機(jī)制相似。然而，另一方面，LNP 內(nèi)的 mRNA 可能通過(guò)疏水、氫鍵和/或靜電相互作用被可電離的脂質(zhì)包裹。在這種情況下，mRNA 可能比溶解在水溶液中的裸露的mRNA更穩(wěn)定。在沒(méi)有進(jìn)一步研究的情況下，只能得出結(jié)論，mRNA 的不穩(wěn)定性導(dǎo)致了儲(chǔ)存條件苛刻。 

儲(chǔ)存條件不同的原因

當(dāng)前 mRNA 疫苗的另一個(gè)有趣方面是，不同廠家疫苗報(bào)告的儲(chǔ)存溫度和相應(yīng)的“有效期"差異很大：從 -80°C 到 2-8°C，從幾天到幾個(gè)月。是否因?yàn)閙RNA 疫苗處的不同導(dǎo)致這種儲(chǔ)存條件的差異？又或者，儲(chǔ)存條件的差異是否與熱穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果相關(guān)或更可靠的方法有關(guān)？這些信息很重要，因?yàn)樯钊肓私鈱?duì)穩(wěn)定性產(chǎn)生積極影響的因素可能是未來(lái)設(shè)計(jì)熱穩(wěn)定mRNA 疫苗的關(guān)鍵突破點(diǎn)。

Acuitas Therapeutics的執(zhí)行官Tom  Madden 曾經(jīng)在采訪中表示，Moderna 和 Pfizer/BioNTech mRNA 疫苗可能具有相同的穩(wěn)定性。后者是否有可能使用更保守的方法來(lái)確保穩(wěn)定性？盡管如此，目前必須在 -60 至 -80 °C 之間儲(chǔ)存的Pfizer/BioNTech mRNA-LNP 疫苗很可能也在更高的溫度和冷藏條件下進(jìn)行了穩(wěn)定性考察，正如CureVac 科學(xué)家所做的那樣。

此外，穩(wěn)定性測(cè)試中的分析技術(shù)在靈敏度上可能不同，驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)也可能不同。疫苗穩(wěn)定性研究報(bào)告的發(fā)布可能對(duì)這些疑問(wèn)作出回答，對(duì)此進(jìn)行比較研究會(huì)是很有趣的工作。